Projekty krajowe

Celem projektu było dostarczenie naukowo udokumentowanych danych na temat działania łącznego wybranych substancji działających szkodliwie na rozrodczość/zaburzających gospodarkę hormonalną, które są składnikami preparatów chemicznych i/lub kosmetyków. Został on realizowany poprzez ocenę występowania interakcji w fazie toksykodynamicznej pomiędzy badanymi substancjami oraz określenie kierunku zmian i rodzaju tych interakcji w przypadku działania łącznego, a także możliwości ich zróżnicowania w komórkach różnego pochodzenia.

W ramach realizacji 3. etapu projektu przeprowadzono ocenę działania cytotoksycznego dwóch parabenów: metylowego (MePB) i propylowego (PrPB) oraz ftalanów: dietylu (DEP), dibutylu (DBP) i diizobutylu (DIBP) oraz bisfenolu A (BPA) na komórki linii CHO-9 wyprowadzonej z układu rozrodczego (jajnika chomika chińskiego) oraz porównano siłę działania cytotoksycznego badanych substancji aplikowanych na komórki CHO-9 pojedynczo z analogicznym działaniem na te komórki dwuskładnikowych równomolowych (1:1) mieszanin tych związków, a także wybranych mieszanin różnomolowych. Dodatkowo przeprowadzono ocenę aktywności metabolicznej komórek linii R2C (ATCC^® CCL-97™) pochodzących z raka komórek Leydiga wyizolowanych z jądra szczura Rattus norvegicus oraz integralności ich błon komórkowych po narażeniu na dwuskładnikowe równo- i różnomolowe mieszaniny MePB i DBP oraz DBP i DIBP.

Do oceny toksycznego działania badanych związków/mieszanin in vitro zastosowano test redukcji bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolu w mitochondriach, który określa aktywność metaboliczną komórek (test MTT), test pochłaniania czerwieni obojętnej oceniający integralność błon komórkowych (test NRU) oraz test klonogenny (CFEA), pozwalający na ocenę następstw toksycznego działania badanych związków chemicznych pojedynczo oraz ich binarnych mieszanin równotoksycznych po długotrwałym narażeniu komórek na podstawie ich zdolności do proliferacji (tworzenia kolonii). Dla każdej z badanych mieszanin równomolowych (1:1) obliczono indeks synergii (SI), będący stosunkiem obserwowanego (rzeczywistego) efektu działania mieszaniny i efektu oczekiwanego, obliczonego na podstawie efektów wywoływanych przez pojedyncze substancje. Przeprowadzono również analizę graficznych interpretacji efektu łącznego działania mieszanin (izoboli) uzyskanych dla mieszanin równo- i różnomolowych. Ponadto, z zastosowaniem techniki holograficznej mikroskopii tomograficznej (HTM), przeprowadzono ocenę zmian morfologicznych w komórkach CHO-9 powodowanych przez ftalan dietylu i bisfenol A pojedynczo i w równotoksycznych mieszaninach dwuskładnikowych.

Projekt II.PB.11. Graficzna interpretacja efektu łącznego działania mieszanin ftalanu dietylu (DEP) i ftalanu diizobutylu (DIBP) na komórki CHO-9, ocenianego na podstawie testu MTT w porównaniu z wartościami teoretycznymi

Projekt II.PB.11. Wpływ pojedynczych badanych substancji na przeżywalność komórek CHO-9 zdolnych do proliferacji; dane są wyrażone jako liczba kolonii utworzonych po narażeniu komórek w stosunku do kontroli

Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że badane substancje o działaniu szkodliwym na rozrodczość/zaburzające gospodarkę hormonalną organizmu w przypadku narażenia komórek CHO-9 na ich dwuskładnikowe mieszaniny równomolowe (1:1) mogą wykazywać synergizm działania składników w zakresie cytotoksyczności ocenianej testem MTT i NRU (w przypadku czterech mieszanin: DEP+DIBP, DEP+BPA, DIBP+BPA, MePB+BPA i PrPB+DEP synergizm obserwowano w obu testach jednocześnie). Obrazy izobol (graficzne przedstawienie interakcji) wykreślonych na podstawie wyników oznaczania wartości IC₅₀ wskazują na występowanie interakcji również pomiędzy składnikami badanych mieszanin różnomolowych (składniki w stosunku molowym 1:3 i 3:1). Synergizm taki zaobserwowano we wszystkich mieszaninach DEP+DIBP, DEP+BPA, DIBP+BPA w obu przeprowadzonych testach wyznaczających wartości IC₅₀ badanych substancji/mieszanin. Komórki CHO-9 wydają się natomiast charakteryzować dość dużą odpornością na hamowanie proliferacji (tworzenie kolonii) pod wpływem działania badanych związków aplikowanych pojedynczo na komórki w stężeniach odpowiadających ½ oraz ⅛ wartości swych IC₅₀. Również zdecydowana większość badanych mieszanin nie wykazywała niekorzystnych interakcji w zakresie zdolności do proliferacji w teście tworzenia kolonii (CFEA), synergizm działania cytotoksycznego stwierdzono jedynie przy narażeniu komórek CHO-9 na mieszaninę PrPB i BPA w stężeniu odpowiadającym ½ wartości IC₅₀. Odwrotny kierunek interakcji zaobserwowano dla dwuskładnikowej równomolowej (1:1) mieszaniny ftalanu dibutylu (DBP) i ftalanu diizobutylu (DIBP), której składniki wykazywały na komórkach CHO-9 antagonizm w zakresie działania cytotoksycznego we wszystkich przeprowadzonych testach (MTT, NRU i CFEA). Komórki męskiego układu rozrodczego pochodzące z jądra szczura (linia R2C) okazały się bardziej wrażliwe na niekorzystne efekty wynikające z łącznego narażenia na równomolowe mieszaniny MePB+DBP oraz DBP+BIBP niż komórki linii komórkowej CHO-9, wyprowadzonej z żeńskiego układu rozrodczego (jajnika chomika chińskiego).

Na podstawie wyników opracowano Materiały informacyjne na temat działania łącznego substancji działających szkodliwie na rozrodczość/zaburzających gospodarkę hormonalną organizmu udostępnione na stronie internetowej CIOP-PIB oraz upowszechnione przez mobilne serwisy informacyjne. Wydano również ulotkę informacyjną pt. Łączne działanie toksyczne na komórki in vitro równomolowych/równotoksycznych (1:1) mieszanin składników produktów przemysłu chemicznego i kosmetycznego działających szkodliwie na rozrodczość/zaburzających gospodarkę hormonalną organizmu (wydano w 100 egz.). Robocze wersje obu produktów przedstawiono do weryfikacji na seminarium w Inowrocławskich Kopalniach Soli „SOLINO” S.A., a ostateczna ich wersja została sprawdzona na seminarium weryfikującym zorganizowanym w CIOP-PIB.

Wyniki przedstawiono w 2 publikacjach naukowych oraz zaprezentowano na 1 konferencji krajowej. Nagrano również 2 posty video poprzez agencję informacyjną eNewsroom, które zostały udostępnione na stronie agencji i opublikowane następnie na stronie internetowej Biznes Interia w sekcji „Gospodarka”, na kanale YouTube, Facebooku i Twitterze.

Jednostka: Pracownia Toksykologii

Okres realizacji: 01.01.2020 – 31.12.2022